La Biomedicina es Molecular: Diagnosticando en la UAM

Resumen: 

El objetivo del proyecto es analizar la implicación de varios sospechosos/as en la desaparición de una vicerrectora de la UAM. Uno/a de ellos/as sabemos que es hemofílico/a. La hemofilia BM mediante técnicas de Biología Molecular a partir de muestras de sangre. Las hemofilias son enfermedades monogénicas (afectan a un solo gen) provocadas por la mutación puntual (una sola base) de un gen que codifica para un factor de coagulación y que se localiza en el cromosoma X. Las hemofilias, como otras enfermedades recesivas ligadas a sexo, se transmiten por madres portadoras (por tanto XX, con un cromosoma X sano y el otro mutado). Sus hijos varones (XY) pueden haber heredado el cromosoma X sano o el mutado. En este último caso, padecerán la enfermedad.

En esta práctica, utilizando la técnica de la PCR, vamos a determinar si el ADN aislado a partir de muestras de sangre, encontradas en un pomo de una puerta y en un tejido, corresponden a un individuo que sabemos que sufre hemofilia. Para poder asegurarlo, compararemos su ADN con los ADNs de varios familiares.

La técnica de PCR (polimerasa en cadena), permite aislar muy fácilmente el fragmento del DNA del cromosoma X que contiene el gen de interés y determinar si contiene o no la mutación. Esto se puede hacer por secuenciación directa o como lo haremos en la práctica, por análisis indirecto, es decir amplificación del fragmento del gen donde se da la mutación puntual,  ya que la mutación afecta al reconocimiento de una nucleasa, enzima que rompe la doble cadena del ADN. Para poder realizar este análisis, debemos incluir el fragmento de ADN obtenido en la PCR, en un plásmido (molécula de ADN circular, típicamente bacteriano), que clonaremos y aislaremos de bacterias y, finalmente, lo cortaremos con la enzima de restricción. Los fragmentos generados se separarán por electroforesis en geles de agarosa (discrimina  por tamaño) y se analizarán por tinción con un tinte fluorescente no tóxico (SYBR-Safe). A lo largo del proyecto discutiremos la importancia y aplicación actual de las técnicas de ingeniería genética. Además, utilizando los resultados del análisis genético familiar se les explicaran las técnicas utilizadas en las pruebas de paternidad. El alumnado realizará todas las técnicas experimentales y participará activamente en las explicaciones y discusión de los resultados. En todo momento contarán con la ayuda del profesorado universitario y de secundaria y personal de apoyo.

1ª Sesión: 

Se facilitará a cada estudiante un cuadernillo con la explicación teórica y práctica de cada sesión. Los/as estudiantes realizarán una breve encuesta para evaluar sus conocimientos teóricos relacionados con el proyecto.

A continuación se plantea el caso de estudio: en el despacho de la vicerrectora se han encontrado dos muestras de sangre. Se sospecha de los/as colaboradores/as de la vicerrectora o de algún miembro de su familia. Se analizará, a partir de una muestra de saliva de los/as colaboradores/as, si alguno/a de ellos/as puede estar implicado. También se sospecha de familiares de la vicerrectora. Se sabe que el marido padece una grave enfermedad, la hemofilia. Se discutirá con el alumnado las características de la hemofilia (síntomas, incidencia, tratamiento y causas genéticas. A continuación se platea hacer un análisis genético familiar de la desaparecida para determinar si las muestras de sangre proceden de ella o de sus familiares. Cada alumno/a asume el papel de los/as protagonistas del estudio y se hace responsable de la manipulación y resultados del análisis genético de su personaje.

Una vez asignados los personajes se hará una breve explicación de las etapas del diagnóstico molecular que van a llevar a cabo a lo largo del campus (PCR, electroforesis, clonaje del producto de PCR, transformación en bacterias, purificación de ADN y restricción del mismo con enzimas). A continuación  se explicará  la técnica de amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) y cada uno/a de los/as alumnos/as pone un ensayo de PCR a partir del ADN de su personaje.  A continuación se explica la técnica de electroforesis mediante la cual pueden visualizar el fragmento de ADN amplificado por PCR. De esta forma prepararán un gel de agarosa que se utilizará al día siguiente para llevar a cabo la electroforesis.

2ª Sesión: 

Los/as estudiantes utilizarán los geles preparados el día anterior para visualizar el producto de PCR. A continuación se explicará cómo introducir (clonar) parte de este producto de PCR en un plásmido bacteriano para construir un ADN recombinante mediante  enzimas de restricción y  ADN ligasa. El DNA recombinante se introducirá en bacterias mediante transformación que crecerán en placas de LB con antibiótico (ampicilina) para asegurar el crecimiento de aquellas bacterias que han integrado el ADN. 

3ª Sesión: 

Este día los/as alumnos/as visualizarán las colonias de bacterias  que sembraron el día anterior y a partir del cultivo en medio líquido que han dejado creciendo durante toda la noche realizarán la extracción del ADN recombinante de las bacterias purificándolo mediante un kit comercial.

4ª Sesión: 

El ADN recombinante purificado se digiere con la enzimática ApaI durante una hora y se explicará previamente el esquema de digestión del ADN que deben observar en el caso de que el individuo porte la mutación. El resultado de la digestión se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa, preparados por los/as alumnos/as. Se interpretará el resultado y se sacarán conclusiones en grupo. Al final de la digestión, ellos/as adquirirán la imagen digital correspondiente y se guardará en el ordenador, para luego ser utilizada por el alumnado en la presentación final.

Se hablará de la estructura de un proyecto de investigación: antecedentes, hipótesis u objetivos, metodología y plan de trabajo, resultados y discusión. Los/as alumnos/as irán encajando su proyecto del campus a este esquema. Al final de la sesión se les proporciona una breve encuesta que nos dará información sobre los conocimientos adquiridos así como el nivel de satisfacción del alumnado y de aquellos aspectos que deben mejorarse.

5ª Sesión: 

A lo largo de la semana los/as alumnos/as habrán estado preparando una presentación del proyecto con ayuda de un/a profesor/a de secundaria. En esta última sesión harán una exposición oral del proyecto y de los resultados que han obtenido a sus compañeros/as de otros proyectos. Se tratara de llegar a una conclusión sobre la desaparición de la vicerrectora.

Mediante esta metodología el alumnado aprenderá conceptos teóricos y reforzarán algunos de los que ya han adquirido en el instituto/centro escolar. Por otro lado, el aprendizaje es dinámico ya que cada alumno/a realizará todo el proceso diagnóstico desde el principio al fin. El hecho de que cada uno/a de ellos/as asuma el papel de uno de los miembros de estudio favorecerá su interés y aumentara la responsabilidad de hacerlo bien.

Referencias recomendadas: 
  • Libros de texto de Biología de Bachillerato
  • Recombinant DNA, Watson J.  
  • Vídeos sobre Biología McGraw Hill (ttp://highered.mcgraw-hill.com/sites/dl/free/0072437316/120060/ravenanimation.html)
Lugar donde se desarrollará el proyecto: 
Universidad Autónoma de Madrid
Facultad de Medicina
C/ Arzobispo Morcillo, 4
28029 Madrid
Campus: 
Departamento: 
Bioquímica-Faculta de Medicina
Provincia: